蛋白實驗雙向電泳技術是等電聚焦和十二烷基硫酸銨-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術的組合,即先進行等電聚焦電泳(按照蛋白質等電點對蛋白質進行分離),然后再進行SDS-PAGE凝膠電泳(按照蛋白質相對分子量大小對蛋白質進行分離),最后經染色得到的電泳圖是個二維分布的蛋白質圖。
等電位聚焦是一種根據分子攜帶的電荷不同來分離分子的技術。蛋白質同時具有酸性基團和堿性基團,在ph值低于等電點時會帶有正電荷,在電場中向陰極移動。將蛋白質置于有遞增ph梯度的凝膠中電泳,蛋白質所帶電荷會一直減少,直到蛋白質移動到ph值與其等電點相同的區域。在此處,蛋白質靜電荷為0,因此停止運動,最終蛋白質被“聚焦”在ph值和其等電點相同的窄帶中。
蛋白實驗蛋白質雙向電泳實驗注意事項:
1.TCA:TCA有毒性,有刺激性氣味,損害呼吸道、眼睛及皮膚,稱量時應戴手套及口罩,避免沾到皮膚及吸入,若不慎接觸,應立即用大量水沖洗后就醫。TCA易潮解,稱量時應迅速。
2.PMSF:PMSF有毒,嚴重損害呼吸道粘膜、眼睛及皮膚,稱量時應戴手套及口罩,避免沾到皮膚及吸入,若不慎接觸,應立即用大量水沖洗后就醫。PMSF溶于異丙醇后置于-20℃長期保存,保存中易析出結晶,用前取出待結晶溶化后再使用
3.甲醛:有刺激性氣味,易揮發,其蒸汽強烈刺激粘膜、眼睛,具有致癌性。使用時應戴手套及口罩,在通風櫥內操作。
4.甲醇:有毒,能引起失明。DTT:很強的還原性,散發難聞的氣味??梢蛭?、咽下或皮膚吸收危害健康。當使用固體或高濃度儲存液時,戴手套和護目鏡,在通風櫥中操作。beta-巰基乙醇:可致命,對呼吸道、皮膚和眼睛有傷害。丙酮:對神經系統有麻醉作用,并對黏膜有刺激作用。